不同elisa方法的原理及步驟

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定法）是一種廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的免疫學(xué)檢測技術(shù)，其核心原理基于抗原與抗體的特異性結(jié)合，并利用酶的催化作用放大信號，從而實現(xiàn)對特定抗原或抗體的檢測和定量分析。根據(jù)實驗?zāi)康暮蜋z測對象的不同，ELISA可以分為多種方法，主要包括直接法、間接法、雙抗體夾心法和競爭性ELISA等。

1. 直接ELISA

原理：

直接ELISA使用酶標(biāo)記的一抗（即一抗直接帶有酶標(biāo)記）與固相載體上的抗原結(jié)合，通過酶催化底物顯色來檢測目標(biāo)抗原的存在和濃度。該方法操作簡單，但靈敏度相對較低。

步驟：

包被：將抗原固定在ELISA板上；

封閉：加入封閉液防止非特異性結(jié)合；

加樣：加入酶標(biāo)記的一抗；

洗滌：去除未結(jié)合的抗體；

顯色：加入底物溶液，酶催化顯色；

讀數(shù)：在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值[。

2. 間接ELISA

原理：

間接ELISA通過兩步抗體結(jié)合（一抗+酶標(biāo)記的二抗）來放大信號，提高了檢測的靈敏度。適用于檢測抗體。

步驟：

包被：將抗原固定在ELISA板上；

封閉：加入封閉液；

加樣：加入待測樣品中的一抗；

加酶標(biāo)二抗：加入與一抗對應(yīng)的酶標(biāo)記二抗；

洗滌：去除非結(jié)合的二抗；

顯色：加入底物溶液；

讀數(shù)：在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值[。

3. 雙抗體夾心ELISA

原理：

雙抗體夾心法用于檢測抗原，原理是使用兩種針對抗原不同表位的抗體（捕獲抗體和檢測抗體），形成“抗體-抗原-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物，適用于大分子抗原的檢測。

步驟：

包被：用捕獲抗體包被ELISA板；

封閉：加入封閉液；

加樣：加入待測抗原；

加酶標(biāo)抗體：加入酶標(biāo)記的檢測抗體；

洗滌：去除未結(jié)合的抗體；

顯色：加入底物溶液；

讀數(shù)：在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值[。

4. 競爭性ELISA

原理：

競爭性ELISA用于檢測小分子抗原或半抗原。原理是將已知量的標(biāo)記抗原與待測樣品中的抗原競爭結(jié)合固相抗體，通過檢測標(biāo)記抗原的結(jié)合量來間接推算樣品中抗原的濃度。

步驟：

1.包被：將特異性抗體包被于ELISA板上；

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2.競爭結(jié)合：向微孔中加入標(biāo)記抗原和待測樣品；

3.洗滌：去除未結(jié)合的抗原；

4.顯色：加入底物溶液；

5.終止反應(yīng)：加入終止液；

6.讀數(shù)：在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值；

7.數(shù)據(jù)分析：通過標(biāo)準曲線計算樣品中抗原濃度[。

總結(jié)

不同的ELISA方法各有其適用范圍和優(yōu)缺點。選擇合適的ELISA方法應(yīng)根據(jù)檢測目標(biāo)（抗原或抗體）、分子大小、靈敏度要求以及實驗條件等因素綜合考慮。對于小分子抗原或半抗原，推薦使用競爭性ELISA；對于大分子抗原或蛋白質(zhì)，雙抗體夾心法是首選；而間接法因其高靈敏度常用于抗體檢測。